MALDI誕生30年小記
作者：周曉光
基質(zhì)輔助激光解吸電離（也就是通常所說(shuō)的MALDI）于1987年首次由Hillenkamp及Karas提出，如今已經(jīng)30年。從那時(shí)起，通過(guò)應(yīng)用這一“軟電離”技術(shù)與飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）的結(jié)合，成功地實(shí)現(xiàn)了為生物大分子提供快速和高度可靠檢測(cè)手段的目的，同時(shí)也為生命科學(xué)領(lǐng)域提供了全新的分析方法。相比其他質(zhì)譜技術(shù)，MALDI-TOF操作簡(jiǎn)便，不需要接受分析化學(xué)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員就可以使用。特別是近年來(lái)在基因分型分析、生物標(biāo)志物鑒定、病原體鑒定、質(zhì)譜成像等應(yīng)用的發(fā)展，越來(lái)越被臨床檢測(cè)領(lǐng)域所青睞。
近幾年，國(guó)內(nèi)在MALDI-TOF MS儀器的研發(fā)與生產(chǎn)快速起步，涌現(xiàn)了一批科研人員和企業(yè)，大大推動(dòng)了MALDI-TOF MS國(guó)產(chǎn)化的進(jìn)程。MALDI-TOF MS將可能成為由中國(guó)企業(yè)掌握的領(lǐng)先核心技術(shù)，并引領(lǐng)技術(shù)發(fā)展的質(zhì)譜儀品類(lèi)，這對(duì)我國(guó)在生物大分子分析研究、臨床分子診斷應(yīng)用等方面有極大的推動(dòng)。
我于30年前開(kāi)始，參與了一系列基于ESI及MALDI質(zhì)譜產(chǎn)品的研發(fā)及研發(fā)管理工作，謹(jǐn)借此技術(shù)發(fā)表30年之際，對(duì)MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及其將來(lái)做作簡(jiǎn)單的回顧與展望。
關(guān)于MALDI的起源
MALDI在2002年與另一“軟電離”技術(shù)電噴霧電離（ESI）同時(shí)得到了諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)的關(guān)注，日本島津公司的田中耕一因激光解吸電離（LDI）技術(shù)的開(kāi)發(fā)，與電噴霧電離的發(fā)明人John Fenn由于“開(kāi)發(fā)了用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟解吸電離方法”而分享了2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。盡管田中耕一的方法使用了基于激光的軟解吸電離方法從而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，但他經(jīng)常被錯(cuò)誤地認(rèn)為是MALDI的發(fā)明人。其實(shí)MALDI（基質(zhì)輔助激光解吸電離）是首次由德國(guó)University of Münster科學(xué)家Hillenkamp及Karas提出的，它與田中所發(fā)現(xiàn)的方法有一些本質(zhì)上的區(qū)別。盡管兩種方法都使用了激光，但在MALDI中，分析物混入基質(zhì)中并被基質(zhì)包圍，基質(zhì)分子吸收激光能量并將其中一部分轉(zhuǎn)移到分析物（如蛋白質(zhì)、核酸分子）上。而田中的方法則是在甘油中使用金屬納米粒子的懸浮液，分析物位于納米顆粒的表面上。
通過(guò)實(shí)踐的驗(yàn)證，Hillenkamp和Karas所開(kāi)發(fā)的基質(zhì)輔助激光解吸的離子化效率更高，成為之后被廣泛采用的技術(shù)。但田中是首先發(fā)表了可以使用激光解吸電離來(lái)分析和檢測(cè)蛋白質(zhì)類(lèi)生物大分子，同時(shí)提醒了我們只是蛋白質(zhì)離子化還是不夠的，必須通過(guò)改進(jìn)儀器的其他部分，尤其是探測(cè)器，而達(dá)到生物大分子分析的目的。
嚴(yán)格意義上講，當(dāng)今被廣泛采用的MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)實(shí)際上是兩個(gè)核心技術(shù)的組合，即基質(zhì)輔助激光解吸電離與飛行時(shí)間離子分離技術(shù)。基質(zhì)輔助激光解吸電離除與飛行時(shí)間結(jié)合外，同樣可以與其它離子分離手段如四極桿、離子阱等相連接。但脈沖式的激光解吸電離方式無(wú)疑與在飛行時(shí)間質(zhì)譜中同樣采用脈沖式離子提取方式在耦合上有著許多優(yōu)勢(shì)，從而促成了MALDI-TOF這一質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)。這一質(zhì)譜儀器的發(fā)展史也是MALDI這一分子電離技術(shù)與TOF離子分離技術(shù)的相互依賴(lài)、相互推進(jìn)的發(fā)展歷程。
脈沖觸發(fā)飛行時(shí)間的質(zhì)譜儀設(shè)計(jì)在MALDI出現(xiàn)之前十幾年就已經(jīng)出現(xiàn)。在美國(guó)Texas A&M University的Macfarlane等通過(guò)放射性元素Californium-252轟擊樣本表面，以放射性自然脈沖觸發(fā)飛行時(shí)間計(jì)時(shí)的原理設(shè)計(jì)了等離子體解吸電離（Plasma Desorption Ionization）飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，并用來(lái)分析較高極性的有機(jī)生物分子，成為當(dāng)時(shí)最為成功、被認(rèn)為最有潛力的蛋白質(zhì)大分子分析的質(zhì)譜工具。1984年首款基于這類(lèi)原理的商業(yè)化產(chǎn)品由Bio-Ion Nordic AB生產(chǎn)并銷(xiāo)售，該公司于1989年被Applied Biosystems Inc.收購(gòu)。但這一技術(shù)可謂是曇花一現(xiàn)，很快就被嶄露頭角的激光解吸技術(shù)所取代。
激光電離（Laser Desorption）被研究得更久，但是直到適當(dāng)吸收激光能量的基質(zhì)被引入前的幾十年中，在生物分子分析中的應(yīng)用非常有限。Franz Hillenkamp，Michael Karas及其同事在80年代中期發(fā)現(xiàn)將丙氨酸與色氨酸混合并用266 nm激光脈沖照射可以更容易地將其電離，從而推斷色氨酸吸收激光能量并幫助非吸收能力的丙氨酸電離，因而賦予了基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）這個(gè)術(shù)語(yǔ)。當(dāng)與這種“基質(zhì)”混合時(shí)，分子量高達(dá)2843 Da的多肽Melittin同樣可被電離。對(duì)更大分子的激光解吸電離的突破發(fā)生在1987年，島津公司的田中耕一和他的同事使用了將甘油中的30 nm鈷金屬粉末與337nm氮?dú)饧す馄飨嘟Y(jié)合的“超細(xì)金屬加液體基質(zhì)法”用于電離。使用這種基質(zhì)與激光的組合，田中完成了對(duì)分子量34,472 Da羧肽酶-A蛋白生物分子的電離，證明了激光波長(zhǎng)和基質(zhì)的適當(dāng)結(jié)合可以使蛋白質(zhì)電離。隨后，Karas和Hillenkamp使用煙酸基質(zhì)和266 nm激光電離了67 kDa的白蛋白（Albumin）。
Karas和Hillenkamp在1988年Bordeaux國(guó)際質(zhì)譜會(huì)議上發(fā)布了使用靜態(tài)電場(chǎng)反射式飛行時(shí)間質(zhì)譜儀結(jié)合MALDI電離獲得的β-半乳糖苷酶（分子量116,900）的光譜圖，首次展示了單電荷離子質(zhì)量大于100,000的質(zhì)譜圖，標(biāo)志著MALDI-TOF MS新時(shí)代的來(lái)臨。
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但從上圖中質(zhì)譜峰寬上可以看出，在初期工作中使用靜態(tài)電場(chǎng)反射式飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得的蛋白質(zhì)量分辨能力是相當(dāng)?shù)偷摹Ｈ藗兒芸炀鸵庾R(shí)到這主要是由于離子在飛行過(guò)程中碎裂所致。
MALDI-TOF MS的誕生
第一臺(tái)用于大分子分析的實(shí)用MALDI-TOF質(zhì)譜儀是由美國(guó)Rockefeller University的Beavis和Chait在Hillenkamp發(fā)現(xiàn)MALDI后的幾個(gè)月內(nèi)搭建的。這是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性飛行時(shí)間質(zhì)譜，采用單靜態(tài)加速電場(chǎng)，漂移管，和探測(cè)器。該儀器的加速電壓高達(dá)30kV，飛行長(zhǎng)度為2米。線性飛行時(shí)間分析儀的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)在于飛行過(guò)程中解離破碎的離子與穩(wěn)定離子幾乎同時(shí)到達(dá)離子探測(cè)器，從而消減了Hillenkamp等在反射式分析器中觀察到的離子色散，提高了質(zhì)量分辨能力。Beavis和Chait還對(duì)MALDI的基質(zhì)進(jìn)行了廣泛的研究，實(shí)現(xiàn)了MALDI的進(jìn)一步的改進(jìn)。其開(kāi)發(fā)的肉桂酸衍生物基質(zhì)表明在260 nm和360 nm紫外波段間的任何波長(zhǎng)都可以用來(lái)激光解吸蛋白質(zhì)，使得波長(zhǎng)為337 nm的更小型和相對(duì)便宜的氮?dú)饧す馄魍瑯涌梢詰?yīng)用在MALDI儀器上，取代了笨重昂貴的Nd:YAG激光器，受到20世紀(jì)90年代初商用儀器開(kāi)發(fā)研究人員的青睞，直到至今還被廣泛采用在商業(yè)化產(chǎn)品中。
首批商業(yè)化MALDI-TOF產(chǎn)品出現(xiàn)于上個(gè)世紀(jì)90年代初，由Dr.Marvin Vestal創(chuàng)建的Vestec公司（被PerSeptive Biosystems收購(gòu)后又并入Applied Biosystems Inc公司）及本人當(dāng)時(shí)所在的Finnigan公司在1990年分別開(kāi)發(fā)生產(chǎn)出MALDI-TOF產(chǎn)品。Finnigan開(kāi)發(fā)的LaserMAT飛行時(shí)間質(zhì)譜儀是首款采用氮?dú)饧す馄鞯木€性MALDI-TOF產(chǎn)品，飛行管長(zhǎng)度只有0.5米。而Vestec生產(chǎn)的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用了更長(zhǎng)的飛行管，因此性能會(huì)好一些。下圖是作者在1991年LaserMAT產(chǎn)品展臺(tái)前的留影。
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相比于幾乎同時(shí)出現(xiàn)的電噴霧電離質(zhì)譜市場(chǎng)的快速發(fā)展及應(yīng)用推廣，初期MALDI-TOF產(chǎn)品商業(yè)化的進(jìn)程遇到了一些麻煩。這主要是由于TOF儀器性能偏低，特別是TOF的質(zhì)量分辨能力不足，質(zhì)量測(cè)量精度不高，如上述Finnigan LaserMAT的質(zhì)量分辨率只有一兩百，不能滿(mǎn)足MALDI電離用于生物大分子的檢測(cè)需求。但從另外一個(gè)角度看，MALDI電離技術(shù)的巨大潛力為飛行時(shí)間質(zhì)量分析器提出了更高的要求，大大刺激了為這種電離技術(shù)特別定制改進(jìn)的TOF儀器的發(fā)展。
TOF技術(shù)的發(fā)展
飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜在上世紀(jì)40年代中期首先由University of Pennsylvania的W.E.Stephens提出。當(dāng)時(shí)在美國(guó)Bendix Aviation Corporation Research Laboratories工作的Wiley和McClaren于50年代中期完成了第一個(gè)實(shí)用型飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜儀的設(shè)計(jì)，并系統(tǒng)的描述了提高質(zhì)量分辨能力的方式，首先提出了脈沖加速的時(shí)間聚焦概念，并描述了實(shí)現(xiàn)聚焦的一般條件。這些條件同樣適用于MALDI以及其他電離技術(shù)，為之后的MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜的發(fā)展打下了理論基礎(chǔ)。但在之后的很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，這項(xiàng)技術(shù)被普遍認(rèn)為是離子特性基礎(chǔ)研究的一種奢侈品，并沒(méi)有被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)及解決實(shí)用問(wèn)題之中。直到上世紀(jì)70年起，由于等離子體解吸電離（PD）、二次離子質(zhì)譜（SIMS），特別是基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）等脈沖離子源的出現(xiàn)，這項(xiàng)技術(shù)才重新引起大家關(guān)注。
早期高分辨MALDI-TOF MS的幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)
理想的離子源是應(yīng)該產(chǎn)生一個(gè)狹窄而幾乎平行的離子束，不同質(zhì)量大小的離子通過(guò)電場(chǎng)加速到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間與離子的初始位置和速度無(wú)關(guān)。而在MALDI解吸電離過(guò)程中，被檢分子是被包埋在沉積在作為離子加速器電極的樣品靶板表面上的基質(zhì)晶體之中的。當(dāng)激光脈沖對(duì)樣本晶體照射時(shí)，產(chǎn)生包括帶電離子在內(nèi)的解吸物質(zhì)羽流。普遍認(rèn)為離子以百米至千米/秒的初始速度分布飛出。如果相同大小的兩個(gè)離子以不同的初速度在飛行管中加速，則它們將在不同的時(shí)間到達(dá)離子探測(cè)器，導(dǎo)致峰展寬。正是由于離子間初速度的不同，造成了線性MALDI-TOF分辨率降低。因此提高線性MALDI飛行時(shí)間分辨率的關(guān)鍵之一就是在對(duì)離子初始速度分布進(jìn)行再聚焦，以補(bǔ)償離子初始速度的差異。Wiley和McClaren在1953年發(fā)表的文章中就已經(jīng)有了具體的描述，但之后被大多科研人員遺忘了。
MALDI離子源出現(xiàn)后，1994年美國(guó)Utah State University的Lennon和Brown報(bào)道了在電離激光脈沖之后采用精確延遲的提取脈沖可以顯著提高M(jìn)ALDI-TOF的分辨能力。Marvin Vestal馬上意識(shí)到并將已經(jīng)報(bào)道過(guò)的MALDI離子初速度分布與線性式和反射式飛行時(shí)間分析儀的聚焦關(guān)聯(lián)連接起來(lái)，花了近一年的時(shí)間系統(tǒng)性地建立了TOF分析儀中各組件的理論模型，用以針對(duì)MALDI離子源的TOF分析器性能優(yōu)化。其中最重要的工作之一就是重新發(fā)現(xiàn)和整合了延遲離子提取（Delayed Extraction），并將其引入到了MALDI-TOF儀器的設(shè)計(jì)中。這一技術(shù)是通過(guò)延遲離子提取電場(chǎng)的施加來(lái)改變不同初始速度的離子被加速的持續(xù)時(shí)間，最終使所有離子都同時(shí)到達(dá)探測(cè)器。這一改進(jìn)將線性飛行時(shí)間的質(zhì)量分辨能力提高了10倍以上。
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另外一種補(bǔ)償MALDI離子生成初始動(dòng)能差異的改進(jìn)是通過(guò)在線性飛行時(shí)間管終端加入離子反射器。反射器（Reflectron）飛行時(shí)間的概念最早是由蘇聯(lián)科學(xué)家Mamyrin于1973年提出，它是由一系列均勻間隔的電極組成，在電極上施加離子飛行方向的反向電場(chǎng)。飛行管中相同m/z離子由于動(dòng)能和速度的差異將導(dǎo)致進(jìn)入反射器深度不同。具有較大動(dòng)能的離子先到達(dá)并進(jìn)入反射器，深入到反射場(chǎng)中飛行路徑比具有較少動(dòng)能的離子更長(zhǎng)，因此與持后離子同時(shí)到達(dá)檢測(cè)器。建立在Marvin的理論研究基礎(chǔ)上，Applied Biosystems公司設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)產(chǎn)生了Voyager系列產(chǎn)品，首次為蛋白質(zhì)大分子分析提供了質(zhì)量分辨能力超過(guò)10,000、質(zhì)量精度高達(dá)10 ppm的高分辨MALDI-TOF質(zhì)譜儀。從90年代中期開(kāi)始，在市場(chǎng)上使用的商業(yè)化MALDI-TOF儀器中有一半以上是基于Marvin的理論設(shè)計(jì)的。
早期的MALDI-TOF儀器雖然有許多優(yōu)點(diǎn)，但有一個(gè)主要限制：它們只能得到分析物的分子量，但無(wú)法測(cè)定結(jié)構(gòu)。因此，這些儀器不能用來(lái)確定對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)家來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的蛋白質(zhì)序列或翻譯后修飾。為了通過(guò)MALDI-TOF獲取蛋白、多肽結(jié)構(gòu)信息，20世紀(jì)90年代早期德國(guó)科學(xué)家Kaufmann和Spengler利用亞穩(wěn)態(tài)衰變離子在無(wú)電場(chǎng)區(qū)域飛行過(guò)程中碎裂后再被反射器分離，從而獲得碎片離子質(zhì)量信息，即所謂的后源衰變（Post Source Decay）技術(shù)，進(jìn)行了多肽測(cè)序的工作。這一手段在某種意義上彌補(bǔ)了MALDI-TOF無(wú)法獲取多肽結(jié)構(gòu)信息的不足，但畢竟PSD碎片離子與通常的MS/MS碎片離子所包含的分子結(jié)構(gòu)精度還是有很大差距。為了彌補(bǔ)這一缺陷，Marvin Vestal通過(guò)完善理論，將其擴(kuò)展到串聯(lián)TOF質(zhì)譜，成功構(gòu)建了MALDI-TOF-TOF儀器的設(shè)計(jì)理論，開(kāi)發(fā)出Applied Biosystems公司的4700蛋白質(zhì)組分析儀及后來(lái)升級(jí)版的AB 4800 TOF-TOF質(zhì)譜儀。這些儀器至今還在大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)中心使用。MALDI-TOF MS和MS-MS系統(tǒng)對(duì)包括蛋白質(zhì)組學(xué)，糖組學(xué)，細(xì)胞信號(hào)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)，細(xì)胞器成像和聚合物科學(xué)等許多重要研究領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響。Marvin也因?yàn)樵贛ALDI-TOF，TOF-TOF方面的貢獻(xiàn)于2010年獲得質(zhì)譜界頒發(fā)的最高獎(jiǎng)美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)。
在MALDI-TOF技術(shù)出現(xiàn)的早期，它主要是被應(yīng)用在蛋白質(zhì)的鑒定中。質(zhì)譜蛋白鑒定的一種方法是通過(guò)將提取的蛋白質(zhì)組經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶的作用分割成多肽，然后比對(duì)MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖中的多肽峰與從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)所生成的多肽質(zhì)量匹配程度，達(dá)到蛋白鑒定的目的。這種方法通常被譽(yù)為肽質(zhì)量指紋譜分析（Peptide Mass Fingerprinting，PMF）。另外一種鑒定蛋白的方法是通過(guò)MALDI TOF-TOF將蛋白內(nèi)切后的產(chǎn)生的多肽在串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)轟撞成離子碎片，然后通過(guò)蛋白多肽串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配多肽信息來(lái)確定蛋白。
相比蛋白和多肽，核酸的MALDI-TOF分析比較遲后，直到Becker研究小組1993報(bào)道了3-羥基吡啶甲酸（3-HPA）可作為良好的基質(zhì)才有所突破。其中一個(gè)爆發(fā)點(diǎn)是應(yīng)用于基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性鑒定。1997年Applied Biosystems的Haff和Smirnov首先建立了利用單堿基延伸（Single-base Primer Extension）化學(xué)與MALDI-TOF相結(jié)合的單核苷酸多態(tài)性（SNP）鑒定的質(zhì)譜方法。這一SNP檢測(cè)的主要優(yōu)勢(shì)在于可以在一個(gè)樣品反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多達(dá)幾十個(gè)SNP位點(diǎn)（如圖所示乳腺癌1號(hào)基因的檢測(cè)）。
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2000年Applied Biosystems就已完成了基于這一方法的商業(yè)化產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。但由于商務(wù)上的考量，并沒(méi)有將這一產(chǎn)品推向市場(chǎng)。而真正出現(xiàn)在市場(chǎng)上基于單堿基延伸質(zhì)譜分析的商業(yè)化產(chǎn)品是幾年后由Sequenom（現(xiàn)為Agena）公司推出的MassARRAY產(chǎn)品。隨著多位點(diǎn)SNP基因分型在臨床及精準(zhǔn)醫(yī)療應(yīng)用中推廣，以單堿基延伸化學(xué)與MALDI-TOF檢測(cè)相結(jié)合的檢測(cè)手段越來(lái)越被重視。
質(zhì)譜成像技術(shù)
在MALDI-TOF技術(shù)出現(xiàn)后，美國(guó)Vanderbilt University的Richard Caprioli意識(shí)到這一分子檢測(cè)技術(shù)具有二維掃描的特性，自90年代中期開(kāi)始了利用激光掃描結(jié)合質(zhì)譜分析的分子成像技術(shù)，探索開(kāi)發(fā)一種新的方法來(lái)確定生物大分子在組織切片中的分布，特別是對(duì)傳統(tǒng)的免疫化學(xué)無(wú)法進(jìn)行分析的樣本。他們使用的方法是用基質(zhì)液滴噴灑冷凍組織切片，并用配備有精細(xì)激光焦點(diǎn)的MALDI-TOF儀器對(duì)組織樣品進(jìn)行掃描。這項(xiàng)技術(shù)，不光可以獲取樣品中的分子信息，同時(shí)可以在無(wú)化學(xué)標(biāo)記的狀態(tài)下獲得生物分子在復(fù)雜表面的空間分布。這一結(jié)合為生物組織學(xué)研究人員提供了可以用于組織表面的直接生物分子表征的化學(xué)“顯微鏡”。
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Richard Caprioli也因在成像質(zhì)譜（Imaging Mass Spectrometry）上的開(kāi)拓性工作，于2014年獲得美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)頒發(fā)的杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)。
MALDI自30年前出現(xiàn)至今已經(jīng)成為分析各種非揮發(fā)性分子，包括蛋白質(zhì)，肽，寡核苷酸，脂質(zhì)，聚糖和其他具有生物分子的成熟技術(shù)。但在常規(guī)臨床檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域中的突破也只是出現(xiàn)在近年的臨床病原體鑒定上。2001年美國(guó)University of Maryland的Ryzhov和Fenselau通過(guò)質(zhì)譜分析微生物細(xì)胞內(nèi)豐富的核糖體蛋白質(zhì)分子指紋，提出了利用MALDI-TOF鑒定病原微生物的可能性。這種質(zhì)譜分子指紋技術(shù)后被驗(yàn)證比基于微生物實(shí)驗(yàn)室通常使用的各種表型和生物化學(xué)測(cè)試方法更精確，速度更快。而且也為微需氧菌、厭氧菌、真菌、結(jié)核分枝桿菌及病毒等難鑒定、難培養(yǎng)病原體的鑒定彌補(bǔ)了生化鑒定方法的不足，被臨床實(shí)驗(yàn)室逐漸所采納。國(guó)外兩家公司布魯克、生物梅里埃推出的以線性MALDI-TOF儀器為基礎(chǔ)的臨床病原微生物鑒定系統(tǒng)已相繼被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）及國(guó)內(nèi)藥監(jiān)部門(mén)批準(zhǔn)用于病原體鑒定的臨床應(yīng)用。
MALDI的局限與改進(jìn)
基于Vestal在90年代中期建立的MALDI-TOF儀器設(shè)計(jì)理論上開(kāi)發(fā)的商業(yè)化產(chǎn)品出現(xiàn)后至今，該技術(shù)從根本上基本沒(méi)有改變。但要進(jìn)一步將此分析方法推向更寬廣的臨床檢測(cè)領(lǐng)域，我們還面對(duì)著不少挑戰(zhàn)，還需克服限制此質(zhì)譜儀器被廣泛接受的許多因素，例如儀器的制造成本和操作復(fù)雜性高，較差的可靠性，以及速度，全譜靈敏度分辨率和質(zhì)譜光譜重現(xiàn)性不佳等。特別是這些因素造成人們普遍認(rèn)為MALDI-TOF不是定量的分析手段，在臨床分析應(yīng)用中的進(jìn)一步推廣也因此受到影響。
要從應(yīng)用角度解決質(zhì)譜定量分析需要從幾個(gè)方面著手：樣品前處理，點(diǎn)樣方式和儀器本身的定量分析誤差。雖然在本世紀(jì)初Applied Biosystems相繼開(kāi)發(fā)了化學(xué)試劑iCAT（Isotope-coded affinity tag）和iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）同位素代碼標(biāo)記定量技術(shù)，在一定程度上緩解了定量分析的瓶頸，但儀器本身的局限一直沒(méi)有得到解決。我們必需從根本上尋找答案，也就是從離子生成、離子提取傳輸和離子檢測(cè)幾個(gè)層次入手。
首先，樣本與基質(zhì)分子形式的結(jié)晶層在MALDI靶板上的分布是不均的，因此優(yōu)質(zhì)的質(zhì)譜圖是需要通過(guò)尋找結(jié)晶層中“甜點(diǎn)”而獲得。而通常此類(lèi)儀器采用的氮?dú)饧す馄鞯陌l(fā)射頻率被限制在50Hz左右，所以通常在單位時(shí)間內(nèi)僅有一小部分（通常<1％）樣品分子被激光照射電離和分析，使每個(gè)疊加后的質(zhì)譜圖中離子強(qiáng)度重現(xiàn)性非常不穩(wěn)定，誤差會(huì)高達(dá)30%以上。而新一代的MALDI-TOF（如融智生物的QuanTOF）采用了5000Hz以上的半導(dǎo)體激光器，結(jié)合快速二維移動(dòng)平臺(tái)控制及高速離子探測(cè)與數(shù)據(jù)采集，可以在相同時(shí)間內(nèi)完成幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)次的激光照射，電離分析靶點(diǎn)上的大部分樣品，減少了樣品數(shù)量變化和分布不均造成的影響。
另外影響質(zhì)量分析重現(xiàn)性的因素包括在MALDI離子源內(nèi)的離子提取及加速電場(chǎng)的施加方式。上一代MALDI-TOF設(shè)計(jì)中，這些電壓是加在靶板上的，造成在整個(gè)靶板上電場(chǎng)分布不均，從而使點(diǎn)在靶板不同位置上的離子感應(yīng)到不同的電場(chǎng)，使得離子飛行時(shí)間的波動(dòng)。而在新一代的儀器設(shè)計(jì)中（如QuanTOF）采用了靶板接地的專(zhuān)利技術(shù)，消除了靶板邊緣電場(chǎng)的波動(dòng)，進(jìn)一步提高了質(zhì)譜光譜的重現(xiàn)性。這一改進(jìn)使質(zhì)量檢測(cè)的均一性會(huì)更好，特別對(duì)需要在空間維度上進(jìn)行掃描的質(zhì)譜成像應(yīng)用有更大的意義。
新一代MALDI-TOF的另一改進(jìn)是在全質(zhì)量范圍的檢測(cè)性能。Wiley和McClaren在50年代就對(duì)飛行時(shí)間（TOF）質(zhì)譜設(shè)計(jì)中無(wú)法對(duì)不同大小離子在初始空間及速度上同時(shí)完成聚焦有了闡述，加上通常MALDI-TOF激光照射入射角度的不對(duì)稱(chēng)性，使得傳統(tǒng)MALDI-TOF儀器設(shè)計(jì)中有造成質(zhì)量偏倚性的許多因素，在不同質(zhì)量區(qū)間的分辨率、靈敏度有較大的區(qū)別。QuanTOF通過(guò)激光照射光學(xué)系統(tǒng)，離子光學(xué)系統(tǒng)，延遲離子提取，離子聚焦傳輸及混合離子檢測(cè)器的創(chuàng)新設(shè)計(jì)及全面改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜分析在全質(zhì)量范圍內(nèi)的分辨率、靈敏度的同步性能提升，提高了質(zhì)譜定量檢測(cè)分析的重現(xiàn)性。
新一代MALDI-TOF的定量分析性能提升可以從全血樣品中血紅蛋白糖化率測(cè)定上看出。下圖中所示為3個(gè)不同糖化率的血紅蛋白樣本（分別為6%，9%，14%），每個(gè)樣本被重復(fù)點(diǎn)在靶板上24個(gè)不同樣點(diǎn)所獲得的72張質(zhì)譜光譜圖的疊加。糖化峰三組不同濃度離子強(qiáng)度的重現(xiàn)性高達(dá)98%以上。
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寬譜可定量MALDI-TOF將打開(kāi)全新應(yīng)用的大門(mén)
創(chuàng)新技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展正在推動(dòng)MALDI-TOF邁向更光明的未來(lái)，它將成為一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)被應(yīng)用于疾病的病理學(xué)，個(gè)體化臨床檢測(cè)領(lǐng)域。MALDI方法可用于分析任何含有目標(biāo)分析物的體液，包括血液和血液制品，母乳，腦脊液，淋巴液，唾液，尿液，胃和消化液，眼淚，大便，精液，前列腺液，陰道液，羊水和來(lái)源于組織的間質(zhì)液。特別是新一代MALDI-TOF定量性能的提升將可更快被用于常規(guī)臨床檢測(cè)使用，除了用于病原體鑒定的用途外，我們將會(huì)看到這一技術(shù)將會(huì)被推廣到：直接從血清，組織提取物和其他體液進(jìn)行的癌癥分型；組織成像；蛋白質(zhì)修飾分析；小分子藥物（體內(nèi)）分布；生物標(biāo)志物的鑒定和驗(yàn)證；質(zhì)譜免疫測(cè)定；多肽定量；診斷和治療相關(guān)生物標(biāo)志物的臨床測(cè)定等。
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周曉光博士
中國(guó)科學(xué)院大學(xué)崗位教授、中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所外國(guó)專(zhuān)家及客座教授、中國(guó)康復(fù)技術(shù)轉(zhuǎn)化及發(fā)展促進(jìn)會(huì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與腫瘤康復(fù)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員、中國(guó)儀器儀表協(xié)會(huì)分析儀器分會(huì)質(zhì)譜專(zhuān)業(yè)委員會(huì)副主任委員，融智生物科技（青島）有限公司董事長(zhǎng)/首席技術(shù)官。
近30年在世界高尖端生命科學(xué)分析儀器公司及研究機(jī)構(gòu)從事分子檢測(cè)儀器產(chǎn)品研發(fā)與研發(fā)管理工作經(jīng)驗(yàn)。利用本人交叉學(xué)科的雄厚背景，帶領(lǐng)研發(fā)團(tuán)隊(duì)完成了涉及質(zhì)譜學(xué)、生物光電子學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)、生物標(biāo)靶挖掘科研工作及相關(guān)分析設(shè)備及應(yīng)用產(chǎn)品的商業(yè)化研發(fā)工作。
2014-融智生物科技有限公司：董事長(zhǎng)/首席技術(shù)官
創(chuàng)建了專(zhuān)業(yè)致力于以尖端生物檢測(cè)分析技術(shù)為核心的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)，從事儀器設(shè)備、試劑耗材、應(yīng)用軟件為一體的生物分子檢測(cè)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售、服務(wù)，為個(gè)體化醫(yī)療、食品安全、疾病防控等各級(jí)生物分子檢測(cè)需求提供多種一體化檢測(cè)解決方案。公司已完成以微流控芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和新一代全譜可定量基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜為核心的生物分子檢測(cè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。
2011-2016中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所：研究組組長(zhǎng)
2011年底加入中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所，任研究員、博導(dǎo)、光電片上系統(tǒng)研究組組長(zhǎng)，并兼任中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所客座教授、技術(shù)研發(fā)中心顧問(wèn)委員會(huì)主任、中科院基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)委員等職。從事應(yīng)用于生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)、新型技術(shù)、儀器裝備、生化試劑、生物信息分析軟件，及其相應(yīng)的整體解決方案的研究工作。合作承擔(dān)完成了多項(xiàng)科研裝備研制項(xiàng)目，包括“基于微流控回路芯片”的數(shù)字化PCR設(shè)備的研發(fā)等，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白，發(fā)表了多篇SCI論文、發(fā)明了多項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。
2008-2010中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所：外國(guó)專(zhuān)家及客座教授
2008年起受邀中國(guó)科學(xué)院參與領(lǐng)導(dǎo)了中科院北京基因組研究所與中科院半導(dǎo)體研究所共同承擔(dān)的中國(guó)科學(xué)院重大科研裝備研制項(xiàng)目“模塊化DNA分析系統(tǒng)”的工作。提出了模塊化設(shè)計(jì)的概念并加以實(shí)現(xiàn)，并負(fù)責(zé)控制軟件和數(shù)據(jù)分析軟件的設(shè)計(jì)與編寫(xiě)，組織實(shí)施了系統(tǒng)的集成調(diào)試工作，提出并實(shí)現(xiàn)了CCD成像、微流系統(tǒng)交叉污染解決方案、數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估方案等。此項(xiàng)目于2011年3月通過(guò)中科院專(zhuān)家組評(píng)審驗(yàn)收，完成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的長(zhǎng)度長(zhǎng)、高通量DNA測(cè)序技術(shù)及其系統(tǒng)樣機(jī)，在高端生命科學(xué)儀器裝備國(guó)產(chǎn)化方面取得了突破性進(jìn)展，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。
1995-2008美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems,Inc）：資深經(jīng)理、研發(fā)部總監(jiān)
1995年加入了美國(guó)Applied Biosystems,Inc.公司的當(dāng)代高分辨率時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)開(kāi)拓者Dr.Marvin Vestal的團(tuán)隊(duì)，從事高分辨生物時(shí)間飛行質(zhì)譜儀的研發(fā)工作。先后參與并領(lǐng)導(dǎo)了多項(xiàng)生物質(zhì)譜分析技術(shù)的研究與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作。參與領(lǐng)導(dǎo)了在最大科學(xué)儀器博覽會(huì)PITTCON上榮獲年度產(chǎn)品獎(jiǎng)的世界首款電噴霧電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的研發(fā)并負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)控制及分析系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與實(shí)施。參與領(lǐng)導(dǎo)了一系列MALDI-TOF技術(shù)及產(chǎn)品的研發(fā)工作，如AB Voyager TOF、AB Proteome Analyzer 4700、AB Proteome TOF-TOF Analyzer 4800等，負(fù)責(zé)開(kāi)發(fā)了建立在此類(lèi)技術(shù)上多項(xiàng)應(yīng)用平臺(tái)，如蛋白質(zhì)組分析系統(tǒng)、組合化學(xué)分析系統(tǒng)、基因組單核苷酸多態(tài)性分析系統(tǒng)、生物標(biāo)志物挖掘分析系統(tǒng)等。
1988-1995美國(guó)賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）：科學(xué)家、高級(jí)工程師、主管工程師、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人
在美國(guó)獲得理學(xué)博士學(xué)位后，加入美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的產(chǎn)品研發(fā)部門(mén)，從事生物質(zhì)譜分析設(shè)備與分析軟件的研究開(kāi)發(fā)工作。參與了早期電噴霧質(zhì)譜儀的研發(fā)，通過(guò)與此技術(shù)發(fā)明者Prof.John Fenn（2002年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）的團(tuán)隊(duì)合作，發(fā)明了解析此類(lèi)譜圖的新方法，獲得美國(guó)專(zhuān)利，成為公司一款全新的分析軟件產(chǎn)品。
參與了利用三重四極桿質(zhì)譜儀（TSQ系列產(chǎn)品）進(jìn)行蛋白質(zhì)/多肽分析技術(shù)的開(kāi)發(fā)工作，獨(dú)自創(chuàng)建了行業(yè)內(nèi)第一款用來(lái)分析此類(lèi)數(shù)據(jù)的生物信息分析軟件。通過(guò)與此類(lèi)分析技術(shù)先驅(qū)者Prof.Don Hunt的合作，成功開(kāi)發(fā)了一款以低能碰撞串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行多肽測(cè)序的計(jì)算手段，并在美國(guó)蛋白質(zhì)學(xué)會(huì)年會(huì)上利用此技術(shù)首次成功的完成了測(cè)試肽測(cè)序任務(wù)，受到同行們的高度贊揚(yáng)。
參與了世界首款電噴霧電離-離子阱多級(jí)質(zhì)譜儀（LCQ系列產(chǎn)品）的研發(fā)工作，負(fù)責(zé)該項(xiàng)目的數(shù)據(jù)控制系統(tǒng)的設(shè)計(jì)及開(kāi)發(fā)，獨(dú)自創(chuàng)建了高智能操作控制ITCL系統(tǒng)，為此設(shè)備的研發(fā)及日后一系列高級(jí)運(yùn)作模式如：數(shù)據(jù)依賴(lài)采集技術(shù)、動(dòng)態(tài)排除技術(shù)、智能化分析等提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)與保障。合作發(fā)明了獨(dú)一無(wú)二的離子阱自動(dòng)增益AGC控制方法并因此獲得美國(guó)專(zhuān)利。此項(xiàng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及之后的衍生產(chǎn)品已成為在多肽/蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域中的世界級(jí)標(biāo)桿產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用。
